동결 주조 마이크로리드 콜라겐 스캐폴드의 위상전이 섬유형성 및 3D 세포 배양

초록

본 연구는 냉동 주조(Freeze‑Casting)로 만든 마이크로리드형 콜라겐 다공성 블록을 암모니아 증기로 위상전이(topotactic) 섬유형성을 유도하여, 물에 안정하고 기계적 강도가 향상된 비가교형 스캐폴드를 제작한다. 완성된 스캐폴드는 3차원 구조에서 인간 피부 섬유아세포와 근육 전구세포(C2C12)의 정렬 및 침투를 촉진한다.

상세 분석

이 논문은 콜라겐 기반 조직공학 스캐폴드 제작 시 가장 큰 난제인 “섬유형성(fibrillogenesis)과 형태제어를 동시에 수행”하는 방법을 제시한다. 기존의 동결 주조는 콜라겐 용액을 급속 냉각해 얼음 결정이 성장하면서 콜라겐을 물리적으로 배치하지만, 얼음 제거 후 남는 콜라겐은 비가교 상태이므로 물에 용해되거나 기계적 강도가 낮다. 저자들은 이러한 한계를 극복하기 위해 두 단계의 위상전이 공정을 도입하였다. 첫 단계는 -5 °C·min⁻¹의 속도로 20 °C에서 –60 °C까지 냉각해 40 mg mL⁻¹ 농도의 콜라겐을 라미나형 다공성 구조로 동결 주조한다. 두 번째 단계에서는 0 °C에서 48 h 동안 암모니아 증기를 노출시켜 얼음이 서서히 녹으며 pH가 상승하도록 함으로써 콜라겐이 국소적으로 중성화되고, 동시에 물‑암모니아 혼합액의 어는점 강하 효과로 얼음‑콜라겐 경계면에서 섬유형성이 시작된다. 이후 37 °C 수증기 환경에서 24 h 배양하고, PBS 5×에 2주 이상 담가 최종 중성 pH에서 완전한 섬유형성을 유도한다. 이 과정은 “위상전이(topotactic) 섬유형성”이라 부르며, 기존에 얼음 결정이 만든 마이크로리드(6–19 µm 간격) 구조를 그대로 유지하면서 콜라겐이 나노섬유로 조직화되도록 한다.

구조적 분석에서는 SEM과 SHG 이미지가 얼음에 의해 형성된 라미나와 리드가 그대로 보존되고, 리드 내부와 벽면에 67 nm 밴딩을 가진 콜라겐 섬유가 관찰되었다. TEM은 작은 나노섬유가 고도로 정렬된 영역과, 보다 굵은 섬유가 파동형 패턴을 보이는 영역을 구분하였다. 기계적 시험에서는 수분 상태에서 1 mm·min⁻¹ 속도로 인장했을 때 평균 영률이 33 ± 12 kPa, 파단 응력이 33 ± 6 kPa, 파단 연신율이 105 ± 28 %에 달했다. 이는 기존 비가교 콜라겐 스캐폴드(수분 상태에서 수백 Pa 수준)와 비교해 수십 배 향상된 수치이며, 섬유형성에 의해 매크로스케일의 연속적인 구조가 형성된 결과로 해석된다.

생물학적 평가에서는 전체 스캐폴드 표면에 인간 정상 피부 섬유아세포(NHDF)를 3주 배양했을 때, 세포가 표면에 고밀도 층을 형성하고 주된 얼음 성장 방향을 따라 정렬되는 것이 확인되었다. 근육 전구세포(C2C12) 역시 11일 배양 후 분화 배지를 4일 추가 적용했을 때, 섬유형성된 콜라겐 리드에 따라 길게 늘어선 다핵 근섬유가 형성되었다. 형광 및 SHG 복합 이미지는 세포핵과 액틴이 리드와 일치하는 방향으로 배열된 것을 보여, 물리적 미세구조가 세포 정렬을 유도함을 증명한다.

핵심적인 혁신은 (1) 냉동 주조 후 바로 암모니아 증기로 위상전이 섬유형성을 유도해 물에 안정한 비가교 스캐폴드를 얻은 점, (2) 리드와 라미나 구조가 매크로·미크로·나노 스케일에서 연속성을 유지해 기계적 강도와 세포 가이드 역할을 동시에 수행한 점, (3) 별도 화학적 가교제 없이도 생리학적 pH와 온도 조건에서 섬유형성을 완결시켜 임상 적용 가능성을 높인 점이다. 이러한 접근은 근육·신경 재생 등 대규모 3D 세포 정렬이 요구되는 조직공학 분야에 직접적인 활용 가치를 제공한다.