3D 피브린 겔에서 살아있는 인간 각막 섬유아세포와 중간엽 줄기세포의 콜라겐 생성 실시간 추적 CARS SHG 다중모달 현미경

초록

본 연구는 라벨‑프리 비침습 영상법인 CARS와 SHG를 결합하여, 3차원 피브린 겔 내에서 인간 각막 섬유아세포와 중간엽 줄기세포가 생산하는 콜라겐을 4주에 걸쳐 실시간으로 모니터링한다. CARS는 세포막 및 지질 소포를, SHG는 비대칭 구조인 콜라겐을 고감도로 검출한다. 초기 몇 시간 내에도 콜라겐을 감지할 수 있는 낮은 검출 한계와 두 영상 모드를 동일 시료에서 순차적으로 획득할 수 있는 장점이 입증되었다. 피브린 겔이 외부 화학·기계적 자극 없이도 MSC의 분화와 콜라겐 합성을 유도함을 확인하였다.

상세 분석

이 논문은 비선형 광학 현미경 기술인 Coherent Anti‑Stokes Raman Scattering (CARS)와 Second Harmonic Generation (SHG)을 통합한 다중모달 시스템을 설계·구축하고, 이를 3차원 피브린 겔 내 살아있는 인간 각막 섬유아세포(hCF)와 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)의 콜라겐 생산 과정을 장기(0‑28일) 모니터링하는 데 적용하였다. CARS는 2844 cm⁻¹ 근처 CH₂ 대칭 신축 진동을 타깃으로 1064 nm 펌프와 1253.7 nm Stokes 빔을 사용해 731.8 nm 파장에서 신호를 생성함으로써 세포막과 지질 소포를 고해상도로 시각화한다. 반면 SHG는 950 nm 펌프를 475 nm 두배 주파수로 변환시켜 비중심대칭 구조인 콜라겐 섬유를 선택적으로 검출한다. 두 모드를 동일 광학 경로와 스캐닝 유닛에 결합함으로써 동일 시료에 대해 연속적인 3D 이미지 스택을 얻을 수 있었으며, Z‑축 스텝은 800 nm, XY 픽셀 피치는 0.23 µm로 설정해 세포 수준의 공간 해상도를 확보하였다. 레이저 출력은 세포 손상을 최소화하기 위해 펌프 25 mW, Stokes <10 mW, SHG 20 mW 수준으로 제한하였다. 이미지 획득 후 SHG 신호는 낮은 대비를 보였으나, ImageJ 기반의 대비 강화, 가우시안 블러, 수동 밝기·대비 조정을 통해 거의 이진화된 이미지로 변환함으로써 콜라겐 분포를 명확히 시각화하였다.

실험에서는 피브린 겔(두께 약 4 mm) 내에 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 hCF와 hMSC를 각각 8회(각 5개 샘플) 배양하였다. 배양일 0, 7, 14, 21, 28에 각각 CARS와 SHG를 순차적으로 촬영했으며, 초기(0일)에는 hCF에서 미세한 SHG 신호가 검출되어 시스템의 검출 한계가 수시간 내 콜라겐 생성까지 도달함을 증명하였다. 7일 차부터는 두 세포군 모두 뚜렷한 SHG 신호를 보였으며, hMSC는 아직 초기 분화 단계에 있음을 시각적으로 확인할 수 있었다. 14‑28일 구간에서는 hCF와 hMSC 모두 콜라겐 섬유가 세포질에 고르게 분포함을 관찰했으며, 핵 영역에서는 SHG가 거의 나타나지 않아 신호가 실제 콜라겐 단백질에 기인함을 재확인하였다. 장기간 반복 촬영에도 레이저에 의한 세포 독성이 없었으며, 세포 증식 및 형태 변화가 정상적으로 진행된 점은 비침습적 영상법의 안전성을 뒷받침한다.

이 연구는 기존의 파괴적·고정·염색 기반 콜라겐 분석(예: 웨스턴 블롯, 면역형광)과 달리, 동일 시료에서 시간에 따른 콜라겐 양과 공간 분포를 연속적으로 추적할 수 있는 방법을 제공한다. 특히 피브린 겔이 외부 자극 없이도 MSC의 ECM 형성을 촉진한다는 사실은 조직공학 스캐폴드 설계에 중요한 생물학적 인사이트를 제공한다. 향후 이 다중모달 현미경은 다양한 3D 배양 시스템, 오가노이드, 그리고 이식 전 전처리 단계에서 세포·스캐폴드 상호작용을 실시간으로 평가하는 도구로 활용될 전망이다.