새로운 DEF TAP 방법으로 H4 히스톤 상호작용 파트너 전면 분석

초록

본 연구는 기존 TAP 방법을 개선한 DEF‑TAP(차등 용출 분획 후 이중 친화 정제) 기술을 도입하여, 6XHis‑Ni²⁺ 결합을 마지막 단계에 사용함으로써 고염도·유기용매 등 가혹한 세척 조건에서도 복합체를 안정적으로 유지한다. 이를 통해 프로테아제 소화 전 다양한 분획을 수행해 복합체 구성원을 보다 넓게 탐지하고, 단백질‑단백질 상호작용의 특성을 추론한다. HeLa 세포에서 추출한 용해성 핵 복합체 중 히스톤 H4와 결합한 파트너들을 분석한 결과, HAT1·RbAp46·RbAp48·MCM2‑7 복합체·DAXX 등 10여 종의 단백질이 확인되었으며, HAT1이 H4의 N‑말단 꼬리와 직접 결합함을 확인하였다.

상세 분석

DEF‑TAP은 기존의 Tandem Affinity Purification(TAP)에서 두 번째 친화 단계로 흔히 사용되는 CBP‑calmodulin 또는 Protein A‑IgG 결합을 대체하여 6XHis‑Ni²⁺ 친화를 적용한다. His‑Ni²⁺ 결합은 고염도(2 M NaCl)·고농도(10 % 아세톤)·pH 변동 등 다양한 가혹 조건에서도 해리되지 않으며, 이는 정제 후 바로 용해성 단백질 복합체를 물리적·화학적으로 분리할 수 있는 기반을 제공한다. 연구팀은 Ni²⁺ 컬럼에 결합된 H4 복합체를 단계적으로 염 농도, pH, 그리고 유기용매(예: 메탄올, 에탄올)로 용출시켜 각각의 용출 분획을 수집하였다. 이후 각 분획을 질량분석(MS) 전용으로 트립신 소화했으며, 이 과정에서 기존 TAP 대비 30 % 이상 더 많은 펩타이드 스펙트럼이 검출되었다. 특히, HAT1·RbAp46·RbAp48은 서로 다른 용출 패턴을 보였는데, HAT1과 RbAp46은 고염도 용출에 강하게 남아 있었던 반면, RbAp48은 저염도 단계에서 빠르게 용출되었다. 이는 HAT1·RbAp46이 H4와 보다 강한 전기적·구조적 결합을 형성하고, RbAp48은 보다 약한 접촉을 유지한다는 가설을 뒷받침한다.

또한, MCM2‑7 복합체(복제 라이선싱에 관여)와 DAXX(세포 사멸 및 크로마틴 재배열에 관여)도 H4와 동시 정제되었으며, 이들 단백질은 높은 염도 용출 구간에서 검출되어 H4와의 결합이 비교적 강인함을 시사한다. 특히, HAT1이 H4의 N‑말단(1‑20 아미노산) 꼬리와 직접 상호작용한다는 사실은, N‑말단이 히스톤 아세틸트랜스퍼라제의 기질 인식에 핵심적이라는 기존 문헌과 일치한다. 연구팀은 N‑말단이 결핍된 H4 변이체를 발현시켜 정제 실험을 반복했을 때, HAT1이 거의 검출되지 않는다는 결과를 통해 이 결합 의존성을 실험적으로 검증하였다.

이러한 결과는 DEF‑TAP이 단백질 복합체의 물리화학적 특성을 단계별로 분리·분석함으로써, 전통적인 TAP이 놓치기 쉬운 약한 상호작용이나 동적 복합체를 포착할 수 있음을 보여준다. 또한, 히스톤 H4와 같은 핵심 구조 단백질의 파트너 맵을 재구성함으로써, 복제, 전사, DNA 손상 복구, 세포 사멸 등 다양한 핵 기능과의 연결 고리를 새롭게 제시한다.