단백질‑전용 시스템에서 나타나는 강인한 일주기 진동 메커니즘: KaiC 인산화의 리듬을 해부하다

📝 Abstract

By incubating the mixture of three cyanobacterial proteins, KaiA, KaiB, and KaiC, with ATP in vitro, Kondo and his colleagues reconstituted the robust circadian rhythm of the phosphorylation level of KaiC (Science, 308; 414-415 (2005)). This finding indicates that protein-protein interactions and the associated hydrolysis of ATP suffice to generate the circadian rhythm. Several theoretical models have been proposed to explain the rhythm generated in this “protein-only” system, but the clear criterion to discern different possible mechanisms was not known. In this paper, we discuss a model based on the two basic assumptions: The assumption of the allosteric transition of a KaiC hexamer and the assumption of the monomer exchange between KaiC hexamers. The model shows a stable rhythmic oscillation of the phosphorylation level of KaiC, which is robust against changes in concentration of Kai proteins. We show that this robustness gives a clue to distinguish different possible mechanisms. We also discuss the robustness of oscillation against the change in the system size. Behaviors of the system with the cellular or subcellular size should shed light on the role of the protein-protein interactions in in vivo circadian oscillation.

💡 Analysis

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1. 연구 배경 및 질문

• 시스템의 단순성: 시아노박테리아 Synechococcus elongatus의 KaiABC 회로는 전사·번역 없이도 일주기 리듬을 만들 수 있다는 점에서 가장 단순한 생물학적 시계 모델이다.
• 기존 모델의 한계: 전이성 전환만을 가정하거나, 복잡한 헥사머‑헥사머 결합을 가정한 모델들이 있었지만, 실험적으로 두 메커니즘을 구분할 기준이 부족했다.
• 핵심 질문: “KaiC 헥사머가 어떻게 서로 동기화되어 전체 집합의 강인한 진동을 유지하는가?”

2. 제안된 두 가지 기본 가정

3. 모델 구조와 수학적 구현

• 상태 변수: 각 헥사머는 Ti (i=0~6) 혹은 Ri (i=0~6) 로 표시, 여기서 i는 Ser431 인산화된 단량체 수.
• 반응 흐름
  1. 인산화/탈인산화: Ti → Ti+1 (KaiA 촉매), Ri → Ri‑1 (자체 탈인산화).
  2. 전이성 전환: T6 → R6 (전이성 전환), R0 → T0.
  3. 단량체 교환: R6 + Tj → Rk + Rl (k+l = 6+j). 교환은 R‑상태를 증폭하는 비선형 항을 제공한다.
• 파라미터: 4개의 기본 속도상수 (k1, k2, k3, kS). 비율 k2/k1, k3/k1, kS/k1이 진동 존재 여부를 결정한다.
• 조건식: 실험적 관찰에 맞추어 kS >> k3 (교환이 전이보다 빠름) 및 k1 > k3 (인산화가 전이보다 빠름) 로 설정.

4. 주요 결과

5. 강인성(Robustness)의 의미

• 생물학적 해석: 세포 내 KaiC 농도는 환경·대사 상태에 따라 변동될 수 있다. 모델이 보여주는 강인성은 실제 세포가 외부 교란에 대해 일주기 리듬을 유지할 수 있는 메커니즘을 제공한다.
• 실험적 검증 포인트:
  1. 단량체 교환 억제 (예: 교환을 방해하는 변이체 도입) → 진동이 급격히 약화될 것.
  2. 전이성 전환 속도 조절 (예: 구조 변이) → 진동 주기가 변하지만 강인성 자체는 유지.

6. 모델의 한계 및 향후 과제

1. 단순화된 반응망
   • 실제 KaiC는 두 개의 인산화 부위(Thr432, Ser431)를 모두 사용한다. 현재 모델은 Ser431만 고려해 복잡성을 낮췄으나, 두 부위 간 순서적 상호작용이 진동에 미치는 영향은 아직 미분석.
2. 단량체 교환 메커니즘의 정량적 파라미터 부족
   • kS 값은 실험적으로 직접 측정되지 않아 추정에 의존한다. 고해상도 단량체 교환 실험(예: FRET 기반)으로 파라미터를 정밀화할 필요가 있다.
3. 세포 내 공간적 이질성
   • 현재 모델은 완전 혼합 가정을 사용한다. 실제 세포는 미세구조(예: 막 결합, 국소 ATP 농도)로 인해 반응이 비균일할 수 있다. 공간적 확산을 포함한 PDE 기반 모델링이 요구된다.
4. 다른 동기화 메커니즘과의 비교
   • 헥사머‑헥사머 직접 결합, ATP‑의존성 피드백 등 대안 메커니즘을 동일한 강인성 지표와 함께 정량 비교하면 모델의 설득력을 높일 수 있다.

7. 종합 평가

• 혁신성: 전이성 전환과 단량체 교환이라는 두 가지 물리‑화학적 현상을 결합해 “단백질‑전용” 일주기 시계의 강인성을 설명한 점이 독창적이다.
• 실험‑이론 연결: 모델이 예측한 농도·부피 강인성은 기존 실험과 일치하며, 새로운 실험 설계(교환 억제, 변이체)까지 제시한다.
• 생물학적 파급효과: 단백질‑전용 리듬이 어떻게 세포 수준에서 안정성을 유지하는지를 보여줌으로써, 복잡한 전사‑번역 기반 시계와의 비교 연구에 중요한 기준을 제공한다.

결론
Eguchi et al.은 KaiC 헥사머의 전이성 전환과 단량체 교환이라는 두 핵심 가정을 통해, 단백질‑전용 일주기 진동이 어떻게 강인하게 유지되는가에 대한 설득력 있는 메커니즘을 제시하였다. 모델은 농도·부피 변화에 대한 강인성을 정량적으로 설명하고, 실험적으로 검증 가능한 구체적 예측을 제공한다. 향후 단량체 교환의 정량적 측정, 두 인산화 부위의 통합 모델링, 그리고 세포 내 공간적 이질성을 포함한 확장 연구가 진행된다면, 이 모델은 일주기 생체시계 연구 전반에 걸쳐 핵심 이론 프레임워크로 자리매김할 것이다.

📄 Content

1
인 체 에서 KaiC 인산화의 견고한 일주기 진동 메커니즘

Kohei Eguchi*, Mitsumasa Yoda*, Tomoki P. Terada, Masaki Sasai

나고야 대학 컴퓨테이셔널 과학·공학부, 나고야 464‑8603, 일본

초록

세 가지 시아노박테리아 단백질(KaiA, KaiB, KaiC)을 ATP와 함께 인 체 배양하면, Kondo 와 그의 동료들은 KaiC의 인산화 수준이 보이는 견고한 일주기 리듬을 재구성하였다(Science 308; 414‑415 (2005)). 이 결과는 단백질‑단백질 상호작용과 ATP 가수분해만으로도 일주기 리듬을 생성할 수 있음을 시사한다. “단백질‑전용” 시스템에서 발생하는 리듬을 설명하기 위해 여러 이론적 모델이 제안되었지만, 서로 다른 가능한 메커니즘을 구분할 명확한 기준은 알려지지 않았다. 본 논문에서는 두 가지 기본 가정에 기반한 모델을 논의한다: KaiC 헥사머의 전대구조 전이 가정과 KaiC 헥사머 간의 단량체 교환 가정이다. 이 모델은 KaiC의 인산화 수준이 안정적인 리듬 진동을 보이며, Kai 단백질 농도 변화에 대해서도 견고함을 유지한다. 우리는 이러한 견고함이 서로 다른 메커니즘을 구분하는 실마리를 제공한다는 점을 보여준다. 또한 시스템 크기 변화에 대한 진동의 견고함도 논의한다. 세포 수준 혹은 세포소기관 수준에서의 행동은 살아있는 세포 내 일주기 진동에서 단백질‑단백질 상호작용이 수행하는 역할을 밝히는 데 도움이 될 것이다.

두 저자는 동등하게 본 연구에 기여하였다.

2. 서론

일주기 리듬 메커니즘을 규명하기 위해, 시아노박테리아는 가장 단순한 리듬을 보이는 생물로 연구되어 왔다. 시아노박테리아 Synechococcus elongatus PCC 7942에서는 kaiABC 유전자 군과 그 산물인 KaiA, KaiB, KaiC 단백질이 리듬 생성에 필수적임이 밝혀졌(1). 이후 Kai 단백질에 대한 연구가 활발히 진행되었다(2‑19). 최근 Kondo와 그의 동료는 KaiA, KaiB, KaiC를 ATP와 함께 배양함으로써 KaiC 인산화 수준의 일주기 진동을 인 체 재구성하였다(20). 이 획기적인 연구는 전사·번역 과정 없이도 단백질‑단백질 상호작용(21)과 ATP 가수분해(22)만으로 리듬을 만들 수 있음을 보여준다.

Kai 단백질 간의 인 체 상호작용은 상세히 규명되었다(4, 19, 21, 23‑26). KaiC는 자체 탈인산화 효소 활성을 가지고 있어, KaiC만 단독으로 배양하면 점차 탈인산화된다(19). KaiC가 KaiA와 함께 배양되면 인산화가 진행되고(4, 19, 21), KaiB는 KaiA의 활성을 억제한다(4, 21). 이러한 관찰은 “인산화 수준이 낮은 KaiC가 KaiA와 결합해 인산화 수준을 높이고, 인산화 수준이 높아지면 KaiB와 결합해 인산화를 억제한다”는 시나리오를 제시한다. 따라서 KaiA, KaiB, KaiC 혼합 용액은 두 단계, 즉 KaiC‑KaiB 친화도가 낮은 인산화 단계와 친화도가 높은 탈인산화 단계로 구분될 것으로 기대된다. 이러한 인산화 의존적 상호작용(21, 23)과 두 단계 존재(23)는 실험적으로 확인되었다. 그러나 견고한 진동 메커니즘은 아직 명확히 규명되지 않았으며, 이는 Kai 단백질 네트워크의 in silico 모델링을 필요로 한다.

두 단계(인산화·탈인산화)는 실험적으로 구분 가능하지만, 두 단계 사이의 시스템 차이는 알려져 있지 않다. KaiC는 용액에서 헥사머를 형성한다(7, 8, 21). van Zon 등(27)과 Yoda 등(28)은 KaiC 헥사머가 두 단계에서 서로 다른 구조적 상태로 전이한다는 가정을 두었다. 각 구조 상태는 KaiA 혹은 KaiB에 대한 친화도가 다르다. 그림 1은 이러한 전대구조 전이 가정에 기반한 가장 단순한 반응 스키마이다. 이 스키마에서는 각 KaiC 헥사머가 두 단계 사이를 전이함에 따라 인산화 수준이 진동한다는 것이 명백하다. 그러나 반응이 확률적으로 서로 다른 시점에 일어나기 때문에, 초기에는 모든 KaiC 헥사머가 같은 위상에 있더라도 개별 헥사머들의 인산화 수준은 비동기화될 것이다. 이러한 비동기화는 다수의 KaiC 헥사머가 모인 집합의 인산화 수준 진동을 흐리게 만들지만, 실제 실험에서는 많은 KaiC 헥사머 집합이 명확하고 견고한 진동을 보인다. 이는 KaiC 헥사머 간에 어떤 형태의 통신이 존재해 다수의 헥사머가 동기화된다는 강력한 증거이다.

가장 단순한 통신 메커니즘은 KaiC 헥사머 간 복합체 형성을 통해 인산화·탈인산화를 촉진하거나 억제하는 것일 수 있다(29‑31). 이러한 상호작용은 비선형 피드백 루프를 구성해 다수 헥사머의 동기화된 진동을 안정화시킬 수 있다. 그러나 현재까지 KaiC 헥사머 간 직접적인 상호작용을 뒷받침하는 실험적 증거는 없으며, 따라서 본 논문에서는 이 경로를 추구하지 않는다.

다른 중요한 실마리는 단량체 교환이다. KaiC 단량체는 KaiC 헥사머 사이에서 교환되며, 이는 진동을 보이는 용액에서 관찰되었다(21, 24, 26). Ito 등은 서로 다른 위상의 진동 샘플을 혼합했을 때, 초기 탈인산화 단계에서 단량체 교환이 동기화를 매개한다는 것을 발견했다(24). 따라서 KaiC 헥사머는 단량체 교환을 통해 서로 통신하고 인산화 수준을 동기화할 수 있다고 가정할 수 있다. 이전 연구에서는 전대구조 전이와 단량체 교환을 모두 포함한 반응 스키마를 이용해 모델 시뮬레이션을 수행했으며, 이 가정만으로도 진동을 유지하고 실험 데이터(단백질‑단백질 상호작용 및 단량체 교환)를 반정량적으로 재현할 수 있음을 보였다(21).

본 논문에서는 이 메커니즘이 생성하는 진동의 견고성을 테스트하고, 실험과 비교한다. Kai 단백질 농도를 변화시켜 진동의 견고성을 검증하고, 제안된 메커니즘이 낮은 농도에서도 진동이 지속되는 이유를 설명한다. 또한 높은 농도에서의 진동을 예측함으로써, 다른 시나리오와의 차이를 부각시킨다. 더 나아가 반응 부피를 세포 내 혹은 세포소기관 수준까지 축소했을 때 진동이 어떻게 유지되는지를 시뮬레이션한다. 작은 시스템에서의 견고성은 살아있는 세포 내 일주기 진동 메커니즘을 밝히는 데 중요한 단서를 제공한다.

다음 절에서는 전대구조 전이와 단량체 교환이라는 두 가정을 이용한 간소화 모델을 먼저 소개하고, 핵심적인 진동 메커니즘을 설명한다. 이후 전체 모델(보강된 반응 포함)을 제시하여 실험과 정량적으로 비교한다. 마지막으로 단량체 교환에 의한 동기화 가정을 다른 가정(26, 27, 32)과 비교하고, 요약 및 논의를 진행한다.

두 가지 기본 가정: 최소 모델

서론에서 논의한 바와 같이, 본 모델의 핵심은 KaiC 헥사머의 전대구조 전이와 단량체 교환이다. 이를 직관적으로 보여주기 위해 그림 2에 나타낸 간소화된 반응 스키마를 먼저 살펴본다.

각 KaiC 헥사머는 이완(R) 상태와 긴장(T) 상태 사이를 전이한다. 탈인산화 단계에서는 전대구조 전이가 더 자주 일어나므로, 탈인산화 단계의 불안정한 헥사머는 R 상태에, 인산화 단계의 헥사머는 T 상태에 있다고 가정한다. KaiC 단량체는 두 개의 인산화 부위(Thr432, Ser431)를 가지고 있다. 실험적으로 Thr432의 인산화·탈인산화가 Ser431보다 먼저 일어나는 것이 확인되었지만, 여기서는 Ser431만을 고려한다. Ser431의 인산화 여부가 KaiC‑KaiB 친화도를 결정하기 때문이다. 따라서 각 헥사머는 i(0‒6)개의 Ser431이 인산화된 단량체 수에 따라 Ri 또는 Ti( i = 0‒6 ) 로 표시한다.

• 인산화 단계(T 상태): KaiA가 KaiC에 결합해 Ser431을 인산화한다. 이는 Ti → Ti+1 로 표현된다.
• 탈인산화 단계(R 상태): KaiB가 KaiC에 결합해 KaiA의 인산화 촉진을 억제한다. 이때 KaiC는 자체 탈인산화 효소 활성을 통해 Ri → Ri‑1 로 진행한다.

이 간소화 모델에서는 KaiA·KaiC·KaiB 결합을 명시적으로 다루지 않고, 위 두 반응을 각각 Ti→Ti+1, Ri→Ri‑1 로 대체한다. 인산화·탈인산화 속도는 서로 비슷하므로 동일한 속도 상수(k₁)를 사용한다.

전대구조 전이는 i가 클수록 Ti → Ri 로, i가 작을수록 Ri → Ti 로 전이율이 높아진다고 가정한다. 가장 간단하게는 T6 → R6 와 R0 → T0 두 경로만을 유효 전이로 두어 원형 흐름을 만든다.

단량체 교환은 탈인산화 단계에서 더 빈번하게 일어난다(21, 24). 따라서 Ri + Rj → Rk + Rl (i + j = k + l) 형태의 교환을 허용한다. 반면 Ti + Tj → Tk + Tl 형태는 무시한다. 특히, 탈인산화 초기에 R6와 Tj 사이의 교환이 가장 활발하므로, R6 + Tj → Rk + Rl (6 + j = k + l) 를 고려한다. 교환 후 생성된 헥사머는 불안정하다고 가정해 R 상태에 머무른다. 이러한 교환은 자동촉매적 특성을 가지며, R6 상태의 농도가 높을수록 교환 속도가 비선형적으로 증가한다.

각 Ti, Ri 의 농도를 [Ti], [Ri] 로 두면, 모델은 다음과 같은 미분 방정식으로 기술된다(식 1). 여기서 Wₖᵢⱼ는 교환 반응에 의해 Ri 가 생성되는 속도이며, 구체적인 이중선형 형태는 부록에 제시한다. 모델은 총 14개의 변수([Ri], [Ti], i=0‒6)와 네 개의 속도 상수(k₁, k₂, k₃, k_S)를 포함한다.

• k₁ : Ti→Ti+1, Ri→Ri‑1 (인산화·탈인산화)
• k₂ : R0 → T0 (전대구조 전이, 인산화 단계 시작)
• k₃ : T6 → R6 (전대구조 전이, 탈인산화 단계 시작)
• k_S : 단량체 교환

시간 단위를 1/k₁ 로 스케일링하면, 시스템은 세 개의 독립 파라미터(k₂/k₁, k₃/k₁, k_S/k₁) 로 완전히 기술된다.

실험적 조건을 고려하면, 단량체 교환은 전대구조 전이보다 훨씬 빠르게 일어나며(k_S

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